Ekstraksi dilakukan dengan preparasi sampel untuk memperoleh ekstrak kasar katepsin. Proses ekstraksi menggunakan ikan cakalang yang sudah post rigor. Daging ikan diambil dan disuspensikan dalam akuades dengan perbandingan 1:1, lalu dihomogenisasi pada suhu 0-4°C. Ekstrak daging hasil homogenisasi disentrifugasi pada 600×g selama 10 menit dan supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada 10.000×g selama 10 menit. Pelet yang dihasilkan dari hasil sentrifugasi kedua kemudian dilarutkan dalam 0,1 M bufer Tris HCl pH 7,4 dengan jumlah yang sama seperti jumlah akuades tadi dan disentrifugasi pada 4.000×g selama 10 menit. Hasil supernatan (ekstrak kasar katepsin) yang diperoleh merupakan protein utama dari mitokondria dan lisosom yang siap untuk diteliti aktivitasnya lebih lanjut. Analisis yang dilakukan meliputi aktivitas enzim katepsin (Dinu et al. 2002), konsentrasi protein (Bradford 1976), dan aktivitas spesifik enzim. Aktivitas spesifik enzim (U/mg) dihitung dengan membagi aktivitas enzim (U/ mL) dengan konsentrasi protein (mg/mL).

Katepsin semi murni diperoleh dengan mengendapkan ekstrak kasar katepsin dibagi menjadi 7 fraksi menggunakan amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 0-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 70%-80% (b/v). Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam amonium sulfat ke dalam supernatan sedikit demi sedikit dan disentrifugasi pada 10.000×g, suhu selama 10 menit.

Karakterisasi enzim katepsin dilakukan menggunakan ekstrak kasar yang diperoleh dari daging ikan cakalang. Tahapan karakterisasi mencakup penentuan suhu optimum, pH optimum, konsentrasi substrat optimum, serta penilaian parameter kinetika enzim.

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan melakukan variasi suhu inkubasi pada saat pengujian aktivitas katepsin dengan suhu 20, 30, 40, 50, dan 60°C. Hemoglobin sebagai substrat dibuat dengan konsentrasi 2% pH 2.

Penentuan pH optimum dilakukan menggunakan pH substrat dan pH bufer yang sama dengan variasi pH 3, 4, 5, 6 ,7. Substrat yang digunakan adalah hemoglobin 2%.

Karakterisasi konsentrasi substrat dilakukan dengan mengubah konsentrasi substrat hemoglobin dengan variasi 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0% (b/v). Hemoglobin sebagai substratnya dibuat dengan konsentrasi 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0% (b/v) pH 2 kemudian direaksikan dengan volume enzim yang sama dan diinkubasi dalam kondisi yang seragam.

Penentuan kinetika enzim katepsin mengacu pada Lehninger (1997). Kecepatan reaksi awal (V₀) dihitung berdasarkan jumlah produk hasil hidrolisis yang terbentuk. Data ini dipetakan dalam kurva Michaelis–Menten untuk menggambarkan hubungan antara konsentrasi substrat dan laju reaksi. Parameter kinetika, yaitu dan ditentukan menggunakan persamaan linear Lineweaver– Burk sebagai representasi kuantitatif dari afinitas katepsin terhadap substrat dan kapasitas maksimum reaksinya.

Aktivitas proteolitik dari katepsin diuji menggunakan hemoglobin sebagai substratnya dengan konsentrasi 2% pH 2. Sebanyak 0,5 mL dari larutan substrat, 0,1 mL bufer Tris pH 7,4 diinkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 mL TCA 5% (w/v). Campuran disaring, dan 1 mL filtrat hasil hasil penyaringan ditambah dengan 1 mL pereaksi folin. Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Selain itu, dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan standar BSA dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin. Unit didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat mengubah substrat menjadi 1µmol tirosin dalam 1 menit. Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus berikut:

Keterangan:

AU = jumlah tirosin yang dihasilkan per mL enzim per menit

P = faktor pengenceran

T = waktu inkubasi

Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan bovine serum albumin sebagai standar. Persiapan pereaksi Bradford dilakukan dengan cara melarutkan 5 mg coomasive brilliant blue G-250 dalam 2,5 mL etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan dengan 5 mL asam fosfat 85% (v/v). Jika telah larut dengan sempurna lalu ditambahkan akuades hingga 250 mL dan disaring dengan kertas saring Whatman no. 1 dan diencerkan 5 kali sesaat sebelum digunakan. Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan cara 0,1 mL enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford, diinkubasi selama 5 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Demikian pula untuk larutan standar dilakukan sama seperti larutan sampel dengan konsentrasi antara 0,1-1,0 mg/mL. Pembuatan larutan standar dilakukan dengan melarutkan bovine serum albumin (BSA) dengan konsentrasi 2 mg/mL yang dijadikan sebagai larutan stok. Larutan stok standar kemudian diberi rentang standar pada konsentrasi berkisar 0,1-1,0 mg/ mL. Larutan standar diukur nilai absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Tahap berikutnya adalah membuat kurva standar dengan absorbansi sebagai ordinat (sumbu y) dan konsentrasi protein sebagai absis (sumbu x). Berdasarkan kurva tersebut dapat ditentukan konsentrasi protein dalam sampel.

Data-data kuantitatif yang diperoleh dari hasil pengujian diolah menggunakan Microsoft Excel 2016. Data disajikan dalam bentuk tabel dan grafik serta dianalisis secara deskriptif. Analisis tersebut mempertimbangkan hasil nilai rata-rata dan standar deviasi yang didapat untuk melihat pengaruh dari setiap perlakuan yang digunakan.

Ekstraksi kasar enzim katepsin dari daging ikan cakalang (K. pelamis) berhasil dilakukan. Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak kasar memiliki rata-rata aktivitas enzim sebesar 0,21±0,01 U/mL dan rata-rata konsentrasi protein 0,3160±0,03 mg/mL. Berdasarkan perhitungan tersebut, aktivitas spesifik rata-rata yang diperoleh pada tahap ini adalah U/mg. Nilai aktivitas spesifik ini berfungsi sebagai data awal (baseline) kemurnian enzim sebelum proses purifikasi lebih lanjut. Adanya aktivitas spesifik yang relatif rendah mengindikasikan bahwa enzim target terekstraksi bersama dengan protein non-enzimatis atau protein pengotor dalam jumlah besar.

Secara komparatif, nilai aktivitas spesifik (0,6695 U/mg) berada dalam kisaran yang wajar untuk ekstrak kasar katepsin ikan. Nurhayati et al. (2013a) mengekstraksi katepsin dari kulit ikan patin melaporkan aktivitas spesifik ekstrak kasar sebesar 0,8163 U/mg dan Fikri et al. (2014) mendapatkan aktivitas spesifik sebesar 0,907 U/mg dari daging ikan patin. Perbedaan nilai ini dapat disebabkan oleh berbagai faktor, termasuk perbedaan spesies ikan, organ sumber enzim, serta kondisi ekstraksi yang sensitif terhadap pH dan suhu (Rozi et al., 2020). Mengingat bahwa katepsin ikan cakalang memiliki karakteristik sebagai acid protease yang bekerja optimal pada pH asam (Yoon et al., 2021), maka proses ekstraksi kasar ini berhasil mempertahankan aktivitas katalitiknya. Oleh karena itu, untuk mengatasi tingginya konsentrasi protein pengotor, tahapan pemurnian selanjutnya melalui presipitasi amonium sulfat menjadi penting untuk meningkatkan aktivitas spesifik secara signifikan dan memastikan pemisahan enzim target dari komponen lain.

Ekstrak kasar yang diperoleh dilakukan presipitasi menggunakan amonium sulfat. Aktivitas spesifik pelet pada beberapa tingkat konsentrasi amonium sulfat mengalami peningkatan dan mencapai aktivitas optimum pada perlakuan konsentrasi amonium sulfat 60-70% Figure 1, sementara aktivitas spesifik pada supernatan menunjukkan penurunan aktivitas spesifik.

Berdasarkan Figure 1 dapat dilihat bahwa terdapat peningkatan aktivitas spesifik pelet pada beberapa tingkat konsentrasi ammonium sulfat dan mencapai aktivitas optimum pada pelet dengan konsentrasi ammonium sulfat 60-70%, sementara aktivitas spesifik pada supernatan menunjukkan penurunan aktivitas spesifik. Enzim yang dihasilkan dari presipitasi 60-70% memiliki aktivitas 1,2 U/mL dan kadar protein 0,16 mg/mL sehingga aktivitas spesifiknya sebesar 7,50 U/mg (Table 1). Nurhayati et al. (2012) menyebutkan bahwa katepsin yang berasal dari ikan bandeng (Chanos chanos Forskall) aktivitas spesifik pelet pada beberapa tingkat konsentrasi amonium sulfat mengalami peningkatan dan mencapai aktivitas optimum pada perlakuan konsentrasi amonium sulfat 70%, sementara aktivitas spesifik pada supernatan menunjukkan penurunan. Enzim yang dihasilkan dari presipitasi 70% memiliki aktivitas spesifik sebesar 4,4643 U/mg dengan kadar protein sebesar 0,2016 mg/mL.

Ammonium sulfat juga digunakan untuk memurnikan enzim katepsin dari ikan tawar meningkat dari 4,0306 U/mg menjadi 5,3475 U/mg (Nurhayati et al., 2013b) dan ikan Trachurus japonicas, dengan hasil aktivitasnya meningkat hingga tiga kali lipat dari enzim kasar 1,43×10-4 U/mg menjadi 3,87×10-4 U/mg (Yoshida et al., 2015). Sementara hasil penelitian Pertiwi et al. (2020) meneliti pemurnian katepsin dari ikan dengan ammonium sulfat meningkatkan aktivitas spesifik dari konsentrasi 40-50% dengan nilai 1,15 U/mg meningkat menjadi 1,4096 U/mg pada konsentrasi 60-70%.

Karakterisasi katepsin dilakukan untuk memperoleh gambaran menyeluruh mengenai sifat katalitik dan respons enzim terhadap berbagai kondisi reaksi yang secara fisiologis relevan bagi proses proteolisis. Analisis ini mencakup evaluasi perubahan aktivitas katepsin pada variasi pH, suhu, dan konsentrasi substrat, serta penentuan parameter kinetika yang menggambarkan afinitas enzim terhadap substrat dan kapasitas maksimum hidrolisisnya.

Pengukuran pH optimum dilakukan untuk mengidentifikasi tingkat keasaman yang memberikan aktivitas maksimum bagi enzim katepsin dari ikan cakalang. Rentang pH yang dilakukan yaitu 3 hingga 7. Aktivitas katepsin cenderung aktif pada lingkungan asam (Yadati et al., 2020), karena konfigurasi pusat aktif enzim lebih stabil pada pH rendah, hal ini sesuai dengan pendapat Nurhayati et al. (2012) bahwa enzim katepsin aktif pada pH asam misalnya bandeng dengan pH 4, sementara penelitian yang dilakukan Fikri et al. (2014) pada daging ikan lele, katepsin memiliki pH optimum 6. Penelitian yang dilakukan oleh Pertiwi et al. (2020) terhadap katepsin yang berasal dari ikan Congresox talabon memiliki aktivitas spesifik optimum pada pH 5. Grafik pengaruh pH terhadap aktivitas enzim katepsin pada ikan cakalang terdapat pada Figure 2.

Nilai aktivitas katepsin menunjukkan pola peningkatan pada pH rendah dan menurun pada pH yang lebih tinggi. Aktivitas tertinggi dicapai pada pH 4 dengan nilai 0,57 U/mg, sedangkan aktivitas moderat terlihat pada pH 3 (0,45 U/mg) dan pH 5 (0,50 U/mg). Aktivitas enzim mengalami penurunan pada pH 6 (0,44 U/mg) dan mencapai nilai terendah pada pH 7 (0,425 U/mg). Hasil menunjukan bahwa katepsin ikan cakalang memiliki karakteristik sebagai enzim proteolitik lisosomal yang bekerja optimal pada pH asam, dengan penurunan aktivitas yang konsisten ketika kondisi mendekati netral. Enzim katepsin dari ikan cakalang bersifat acid protease, sejalan dengan protease lisosomal yang umum ditemukan pada ikan (Yon et al., 2021). Nilai aktivitas tertinggi pada pH 4 mengindikasikan bahwa pelepasan katepsin dari lisosom pada kondisi pascamortem berpotensi mempercepat degradasi protein ketika pH otot ikan bergerak ke arah asam akibat penurunan glikogen dan pembentukan asam laktat.

Pengukuran suhu optimum dilakukan untuk mengidentifikasi tingkat keasaman yang memberikan aktivitas maksimum bagi enzim katepsin dari ikan cakalang. Rentang pH yang dilakukan yaitu 20-60°C. Kenaikan suhu meningkatkan aktivitas spesifik enzim katepsin sampai pada titik tertentu, sementara peningkatan suhu lebih lanjut membuat aktivitas spesifik enzim menurun. Energi kinetik molekul enzim dan substrat meningkat saat suhu naik, menyebabkan tumbukan antar keduanya lebih sering dan cepat (McLeod et al., 2024). Karakteristik suhu pada enzim katepsin disajikan pada Figure 3.

Titik puncak performa enzim atau suhu optimum ditemukan pada suhu dengan nilai aktivitas tertinggi sebesar 0,70 U/mg. Konfigurasi struktural protein katepsin pada titik ini berada dalam kondisi yang paling ideal, cukup fleksibel untuk mengikat substrat di sisi aktifnya, namun tetap stabil secara termal. Aktivitas spesifik pada suhu optimum ini mencapai 2,215 U/ mg, menandakan efisiensi katalitik yang maksimum dibandingkan perlakuan suhu lainnya. Namun, setelah melewati suhu terjadi penurunan aktivitas yang sangat signifikan. Aktivitas merosot ke angka 0,26 U/ mg pada suhu dan terus turun hingga 0,10 U/mg pada suhu . Hasil ini sejalan dengan penelitian Nurhayati et al. (2012) enzim katepsin ikan bandeng optimum pada suhu dengan aktivitas spesifik 6,4982 U/mg dan terus turun seiring meningkatnya suhu. Hal tersebut diperkuat penelitian Rozi et al. (2020) yaitu enzim katepsin lele optimum pada suhu 30-37oC dengan nilai aktivitas sebesar 0,386-0,439 U/mL.

Penurunan aktivitas enzim mengindikasikan bahwa enzim katepsin mulai mengalami denaturasi termal. Suhu yang terlalu tinggi merusak ikatan hidrogen dan interaksi non-kovalen yang menjaga struktur tiga dimensi enzim, menyebabkan sisi aktifnya berubah bentuk sehingga tidak lagi mampu berikatan dengan substrat secara fungsional. Nalinanon et al. (2010) menyatakan bahwa penurunan aktivitas enzim dapat disebabkan proses denaturasi. Denaturasi enzim menyebabkan perubahan struktur sekunder atau tersier serta menyebabkan berkurangnya kemampuan katalisis katepsin. Panas berlebih memutuskan ikatan kimia yang menjaga bentuk sisi aktif enzim, membuatnya tidak lagi cocok dengan substrat, sehingga laju reaksi menurun atau enzim kehilangan fungsinya secara permanen(Shaker et al., 2024).

Substrat merupakan molekul yang diikat dan diuraikan oleh enzim, sehingga keberadaannya sangat penting dalam menentukan laju reaksi enzimatik. Substrat dalam karakterisasi enzim, berfungsi sebagai komponen utama yang berinteraksi dengan sisi aktif enzim untuk menghasilkan produk reaksi. Penambahan konsentrasi substrat umumnya akan meningkatkan aktivitas enzim hingga mencapai titik tertentu, yaitu saat seluruh sisi aktif enzim telah terikat sepenuhnya. Kondisi ini disebut juga sebagai konsentrasi substrat maksimum atau keadaan saturasi (Rozi et al., 2020). Penambahan substrat pada titik tersebut tidak dapat lagi meningkatkan laju reaksi karena kapasistas enzim telah mencapai batas optimalnya. Substrat yang umumnya digunakan pada enzim katepsin adalah hemoglobin.

Hemoglobin merupakan proteinpigmen kompleks yang mengandung zat besi, memiliki warna merah dan terdapat di dalam eritrosit (Rozi et al., 2020). Protein ini digunakan sebagai substrat karena struktur polipeptidanya relatif mudah dihidrolisis oleh katepsin, sehingga sesuai untuk mengukur aktivitas proteolitiknya. Mekanisme enzim katepsin menghidrolisis hemoglobin, terjadi ketika katepsin terlebih dahulu berikatan dengan rantai polipeptida hemoglobin melalui sisi aktif enzim yang memiliki residu katalitik spesifik. Kompleks enzim dan substrat yang terbentuk, selanjutnya katepsin akan memutus ikatan peptida pada titik-titik tertentu melalui proses katalisis asam basa yang melibatkan gugus aktif pada enzim (Liu et al. 2022). Pemutusan ikatan ini menghasilkan fragmen peptida yang berukuran lebih kecil, dan akan terdeteksi melalui peningkatan absorbansi pada panjang gelombang 750 nm.

Berdasarkan hasil pengujian (Figure 4), aktivitas enzim katepsin yang diekstraksi dari ikan cakalang menunjukkan peningkatan seiring dengan bertambahnya konsentrasi hemoglobin. Konsentrasi substrat 0,5% menghasilkan aktivitas sebesar 0,178 U/ mL, kemudian meningkat bertahap hingga mencapai 0,722 U/mL pada konsentrasi substrat 2,5%. Rozalia et al. (2025) menyebutkan peningkatan efektivitas pada penambahan substrat menunjukkan bahwa semakin banyak molekul substrat yang tersedia, semakin sering terjadi tumbukan efektif antara substrat dan sisi aktif enzim sehingga laju reaksi bertambah.

Aktivitas enzim pada konsentrasi 3% mulai mengalami penurunan, menurut Mbira (2024) hal ini menandakan bahwa sistem mulai mendekati kondisi jenuh atau fase awal substrate inhibition, yaitu kondisi ketika kelebihan substrat justru menghambat pembentukan kompleks enzim-substrat.

Hal tersebut juga dapat disebabkan oleh konsentrasi substrat yang tinggi menyebabkan kompetisi atau gangguan interaksi pada sisi aktif. Pola kenaikan yang menurun setelah konsentrasi 2,5% menunjukkan bahwa enzim telah mendekati kapasistas maksimal, sehingga penambahan substrat tidak lagi menghasilkan peningkatan aktivitas yang signifikan.

Analisis kinetika enzim menggunakan plot Lineweaver-Burk(Figure 5) diperoleh bahwa nilai enzim katepsin dalam peneltian ini sebesar 1,588 U/mL, yang menunjukkan kapasistas maksimum enzim ketika seluruh sisi aktif berada dalam kondisi jenuh oleh substrat. Nilai diperoleh sebesar 4,093% (w/v) yang mengindikasikan bahwa enzim membutuhkan konsentrasi hemoglobin sekitar 4,09% untuk mencapai setengah dari kecepatan maksimumnya, sehingga afinitas enzim berada pada kategori sedang. Kondisi ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi substrat rendah, laju reaksi masih terbatas karena banyak sisi enzim yang belum berinteraksi dengan substrat. Pola pada hasil ini sejalan dengan beberapa penelitian yang melaporkan bahwa aktivitas katepsin yang diekstraksi dari daging ikan umumnya meningkat tajam pada konsentrasi substrat yang lebih tinggi. (Rozi et al., 2020) dan (Nurhayati et al., 2012) melaporkan bahwa kenaikan konsentrasi substrat dari 1,5% hingga 3% menghasilkan peningkatan efektivitas yang signifikan.