Sampel diperoleh dalam keadaan beku dari Bangka Belitung, sampel dikemas dengan stirofoam berisi es, dikirim menggunakan kapal dan diantarkan ke laboratorium menggunakan mobil pengangkut. Sampel selanjutnya dicairankan dan dibersihkan dari sisa isi perut dan darah dalam lambung menggunakan air mengalir. Lambung yang sudah bersih diukur morfometriknya baik dari panjang tebal dan diameternya, kemudian dipotong kecil menjadi ukuran 1×1 cm menggunakan pisau. Selanjutnya diekstraksi menjadi pepsinogen mengikuti Bougatef et al.(2008). Tahapannya diawali dengan pemberian nitrogen, lalu dihaluskan menggunakan blender. Proses ekstraksi dilakukan dengan bufer tris-HCl pH 7,5. Campuran yang telah diperoleh kemudian disentrifugasi (FC5718R 120V) selama 15 menit pada 10.000 g pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh disebut pepsinogen.

Aktivasi pepsin dilakukan mengikuti Jurado et al. (2012) dengan menurunkan pH pepsinogen menjadi 2 melalui penambahan HCl 3 N (Emsure) dan dibiarkan selama 10 menit, kemudian ditambahkan NaHCO 2 N (Emsure) untuk menaikan pH menjadi 2,75. Sampel diendapkan selama 6 jam, disaring untuk menghasilkan supernatan berupa larutan pepsin. Pepsin yang diperoleh dilakukan uji aktivitas pepsin dan konsentrasi protein untuk menentukan aktivitas spesifik pepsin yang dihasilkan.

Kulit tuna diperoleh dalam keadaan beku. Selanjutnya kulit dicairakn dan dibersihkan dengan air mengalir. Pembersihan kulit tuna bertujuan untuk menghilangkan kotoran dan benda asing. Kulit dibersihkan dari sisik dan daging yang masih tersisa.

Tahap pretreatment kulit ikan tuna dilakukan mengikuti (Nalinanon et al., 2010) dengan modifikasi. Pretreatment dilakukan melalui dua tahap yaitu deproteinasi dandelipidasi. Proses ini dilakukan pada suhu 10oC dengan merendam kulit ikan dalam larutan NaOH (Emsure) 0,1 M 1:10 (b/v) selama 12 jam. Larutan NaOH diganti setiap 2 jam. Kulit ikan dicuci dengan akuades hingga pH netral. Selanjutnya sampel dilakukan proses penghilangan lemak dengan larutan butil alkohol (Emsure) 10% selama 18 jam dengan penggantian setiap 6 jam, kemudian dicuci dengan akuades. Sampel hasil pretreatment direndam dengan pelarut asam asetat (Emsure) 0,1 M dengan perbandingan kulit dan pelarut yaitu 1:10 (b/v) pada suhu 10oC. Perendaman dilakukan selama 24 jam. Setelah 24 jam campuran disaring, dipisahkan antara larutan dan swollen skinn (sampel kulit) yang dihasilkan.

Swollen skin yang diperoleh dihidrolisis dengan enzim pepsin mengikuti penelitian Benjakul et al. (2017) dan Benhabiles et al. (2012) dengan modifikasi. Hidrolisis dilakukan menggunakan enzim pepsin dengan perbandingan sampel dan pepsin 1:2 (b/v) dengan aktivitas bertingkat, pada suhu 40, 50, 60oC menggunakan waterbath selama 4 jam. Setelah selesai, sampel dilakukan proses inaktivasi enzim dengan suhu 90oC dengan waterbath selama 15 menit. Hidrolisat yang dihasilkan disentrifugasi (FC5718R 120V) dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit. Hasil supernantan yang diperoleh merupakan hidrolisat kolagen.

Analisis aktivitas pepsin berdasarkan literatur dari (A. et al., 2008)(E. et al., 2012)dengan modifikasi dilakukan menggunakan haemoglobin sapi sebagai substratnya. Substrat dilarutkan dengan tris-HCl 10 mM pH 2 dengan konsentrasi 2%. Substrat diambil sebanyak 0,625 mL ke dalam tabung mikro dan ditambahkan pepsin sebanyak 0,125 mL setelah itu dihomogenkan dan diinkubasi dalam kurun waktu 15 menit pada suhu 50°C Penambahan TCA 10% kemudian dilakukan sebanyak 0,4 mL untuk menghentikan reaksi. Sampel larutan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 g dalam waktu 10 menit. Pembuatan blangko dilakukan dengan mencampurkan hemoglobin dan akuades. Supernatan diambil dan ditentukan nilai absorbansinya pada panjang gelombang 280 nm. Unit aktivitas pepsin didefinisikan sebagai peningkatan absorbansi 0,001 per menit, sehingga aktivitas pepsin dapat dinyatakan sebagai berikut:

Keterangan:

= unit aktivitas (AU/mL)

= absorbansi pada panjang gelombang 280

= absorbansi blangko

= volume enzim

= waktu inkubasi

Analisis Konsentrasi Protein dilakukan dengan metode Bradford (1976). Pembuatan larutan standar dilakukan dengan melarutkan bovine serum albumin (BSA) dengan konsentrasi 2 mg/mL yang dijadikan sebagai larutan stok. Larutan stok standar kemudian diberi rentang standar pada konsentrasi berkisar 0,1-1,0 mg/mL. Larutan standar diukur nilai absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

Analisis histologi dilakukan berdasarkan (Angka et al., 1990), diawali dengan persiapan dan pengamatan sediaan di bawah mikroskop cahaya. Kulit (1×1×0,5 cm2) digosok dengan larutan fiksatif BNF, kemudian didehidrasi menggunakan alkohol standar dengan rentang 70% selama 24 jam, 80% selama 2 jam, 90% selama dua jam, 95% selama 2 jam, dan 100% selama 12 jam. Sampel kemudian dibersihkan dengan merendam sampel dalam cairan alkohol mendidih: xylol (1:1) selama 30 menit, diikuti oleh fase impregnasi (embedding). Fase embedding menghilangkan zat pembersih dari jaringan dan menggantinya dengan parafin. Sampel direndam dalam larutan xilena: parafin (1:1) dalam gelas kaca selama 45 menit dalam oven pada suhu Sampel kemudian dicetak dengan parafin cair hingga 1/8 bagian dari ukuran cetakan hingga agak beku. Parafin cair selanjutnya diberikan hingga meresap dan dibiarkan membeku pada suhu kamar selama 24 jam. Sampel yang berbentuk blok parafin kemudian dirapikan menggunakan silette dan dipotong dengan ketebalan 4 μm menggunakan mikrotom berputar untuk mendapatkan slide yang telah disiapkan.

Analisis Bobot Molekul dilakukan dengan metode SDS-PAGE (Laemmli 1970). Sampel sebanyak 2 mg dilarutkan dalam 1 mL sodium dodecyl sulfate (SDS) 5% dan campuran diinkubasi pada suhu 85ºC selama 1 jam dalam waterbath yang suhunya terkontrol. Campuran disentrifugasi pada 4.000 g selama 5 menit pada suhu kamar. Supernatan yang diperoleh dicampur dengan bufer (tris HCl 60 mM, pH 6,8 mengandung 2% SDS dan 25% gliserol) dengan rasio 1:1 (v/v) dan mengandung 10% β-merkaptoetanol (β-ME). Campuran dipanaskan dalam air mendidih selama 2 menit. Sampel sebanyak 5 μL dimasukkan ke dalam gel polyacrylamide yang terdiri dari 7,5% running gel dan 3% stacking gel. Marker yang digunakan yaitu marker protein coomassi blue staining dengan bobot molekul 10-250 kDa. Elektroforesis dijalankan secara konstan pada arus 13 mA dan tegangan 100 volt selama 2 jam. Gel dikeluarkan dari slab kaca kemudian dilakukan proses staining dan destaining. Proses staning dengan coomasie briliant blue selama 1 jam, sedangkan destaining selama kurang lebih 2 jam hingga pita-pita protein terlihat jelas.

Derajat hidrolisis dihitung berdasarkan rasio trichloroacetic acid (TCA) mengikuti metode Hoyle dan Merritt (1994). Sebanyak 20 mL hidrolisat ditambahkan TCA 20% sebanyak 20 mL, lalu didiamkan selama 30 menit . Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 7,800 g selama 15 menit. Supernatan diambil dan dianalisis kandungan nitrogennya dengan metode Kjeldhal (AOAC 2005).

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan menggunakan metode azinobiz ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) berdasarkan Re et al. (1999) dengan modifikasi dan 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) mengikuti (P. et al., 2019) dengan modifikasi. Preparasi reagen ABTS dilakukan dengan mencampurkan ABTS (7,4 mM) dengan (2,6 mM). Reagen yang telah dicampurkan tersebut dilakukan inkubasi selama 18 jam dalam suhu ruang. Reagen yang telah diinkubasi kemudian diencerkan menggunakan etanol hingga diperoleh nilai absorbansi sebesar 0,8 pada panjang gelombang 734 nm. Reagen DPPH dibuat dengan mencampurkan DPPH 5 mg dengan metanol 50 mL untuk membuat reagen DPPH 100 ppm. Sampel yang akan diuji dilakukan pengenceran menggunakan akuades dengan konsentrasi bertingkat (20, 50, 100, 200, 250 ppm) untuk mementukan nilai sampel uji. Sampel disiapkan sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan reagen ABTS sebanyak 1 mL. Campuran tersebut didiamkan selama kurang lebih 10 menit pada suhu ruang. Absorbansi dari campuran diukur menggunakan panjang gelombang 734 nm. Pengujian DPPH dilakukan pada panjang gelombang 517 nm. Persentase aktivitas antioksidan atau inhibisi (penghambatan) dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:

Keterangan:

= absorbansi blangko

= absorbansi sampel

Aktivitas penghambat angiotensin converting enzyme (ACE) diukur berdasarkan laju pembentukan asam hippurat dari hippuryl-L-histidyl-L-leusine (HHL) mengkuti metode (K. et al., 2001). Pengujian dilakukan dengan dengan 4 jenis variabel berupa kontrol (ACE+substrat), blangko kontrol (substrat+akuades), sampel (ACE+substrat+sampel) dan blangko sampel (sampel+substrat). Sampel 50 µL (10 mg/mL) ditambah 125 µL bufer substrat (7.6 mM HHL dan 608 mM NaCl dalam 10 mL bufer borat pH 8.3) campuran diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Selanjutnya 50 µL enzim ACE 50 mU/mL ditambahkan pada campuran kemudian diinkubasi selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 200 µL HCl 1 N. Campuran divortex, ditambah dengan 1140 µL etil asetat kemudian disentrifugasi10.000 g selama 10 menit. Supernatan sebanyak 800 µL diambil dan dikeringkan pada suhu 95°C selama 90 menit. Asam hipurat yang terbentuk dilarutkan ke dalam 2 mL akuabides. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 228 nm menggunakan spektro UV-Vis. Perhitungan aktivitas inhibitor ACE yaitu sebagai berikut:

Keterangan:

= absorbansi kontrol (ACE+substrat)

= absorbansi blangko kontrol (substrat+akuades)

= absorbansi sampel (ACE+substrat+sampel)

= absorbansi blangko sampel (sampel+substrat)

Rancangan penelitian dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap faktorial (RALF) dengan 2 faktor. Proses hidrolisis terdiri atas faktor perbedaan aktivitas enzim penghidrolisis dan suhu hidrolisis dengan masing-masing 3 kali ulangan. Data pengamatan terlebih dahulu diuji normalitas dan homogenitas, kemudian dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji Tukey pada taraf kepercayaan 95% (α= 0,05).

Pepsin merupakan enzim pencernaan utama yang berasal dari lambung hewan dan disekresikan sebagai pepsinogen dari sel-sel utama kelenjar oksintik pada epitel dinding lambung. Lambung merupakan organ yang berfungsi sebagai tempat penampungan makanan untuk dicerna dan dihancurkan. Kenampakan dari lambung tuna berwana merah pucat dengan tekstur berserat pada bagian dalam lambung (Figure 1).

Hasil rata-rata pengukuran morfometrik (n13) yang diperoleh pada lambung tuna sirip kuning adalah panjang 30,58±0,4 cm; lebar 7,38±0,58 cm dan bobot 202,85±16,17 g. Selanjutnya lambung dilumatkan untuk mengekstraksi pepsin. Enzim pepsin yang diperoleh selanjutnya diuji kemampuan aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Aktivitas pepsin dan konsentrasi protein disajikan pada Table 1.

Nilai rerata aktivitas pepsin yang diperoleh adalah 5.697,78U/mL dengan nilai konsentrasi protein 0,48 mg/mL sehingga aktivitas spesifik yang diperoleh adalah 12.332,91 U/mg. (S. et al., 2010) melaporkan ekstraksi enzim pepsin dari lambung cakalang dan albakor diperoleh nilai aktivitas spesifik masing masing sebesar 0,3181 U/mg dan 0,124 U/mg. Perbedaan aktivitas spesifik sampel dipengaruhi oleh konsentrasi protein sampel yang dihasilkan. Konsentrasi protein sampel yang kecil dipengaruhi oleh metode ekstraksi sampel, dimana metode ekstraksi yang dilakukan menggunakan bahan baku yang masih mentah tanpa proses perubahan bahan baku menjadi powder seperti pada (S. et al., 2010), sehingga jumlah konsetrasi protein yang dihasilkan lebih kecil. Aktivitas enzim pencernaan bervariasi tergantung pada spesies. Hal ini dipengaruhi oleh faktor biotik yaitu usia, ukuran, dan faktor abiotik yaitu makanan, suhu, dan parameter musim, yang dapat mengubah profil dari enzim atau mengubah aktivitas enzim (Riaz & Naeem, 2020).

Proses selanjutnya adalah hidrolisis kulit tuna dengan pepsin yang telah diperoleh. Sampel kulit tuna diuji untuk melihat komposisi kimia dari bahan baku kulit tuna yang digunakan. Hasil pengujian proksimat bahan baku kulit tuna disajikan dalam Table 2.

Hasil pengujian menunjukan komposisi kimia paling besar terdapat pada kadar air, yang diikuti oleh kadar protein. Kadar protein sampel tuna sirip kuning yang digunakan pada penelitian ini, memiliki kadar protein yang tidak berbeda jauh pada spesies tuna yang diperoleh (H, 2014) dan (S. et al., 2017) Kulit merupakan salah satu bagian dari sumber protein selain daging. Sebagian besar komponen dari kulit merupakan protein kolagen. Kolagen adalah protein jaringan ikat yang termasuk dalam kelas protein yang menyerupai serat fibrilar atau jaringan scleroprotein. Kandungan kolagen yang tinggi pada kulit dapat diketahui melalui kandungan asam aminonya. Glisina menyusun hampir sepertiga dari struktur kolagen sedangkan sisanya merupakan asam amino yang lain (Chi et al., 2014). Hasil pengujian asam amino kulit tuna disajikan pada Table 3.

Hasil analisis asam amino kulit tuna sirip kuning didominasi oleh glisina dengan 87.686,17 mg/kg; diikuti prolina 65.498,03 mg/kg dan alanin 27,948.33 mg/kg. Kulit yang tersusun sebagian besar atas protein kolagen, memiliki struktur kimia unik karena mengandung kadar yang sangat tinggi dari glisina, prolina, dan Hyp dalam bentuk tripeptida berulang (glisina–prolina-Y dan glisina–X-Hyp, di mana X dan Y dapat berupa asam amino apa pun). Protein kolagen mengandung 1/3 glisina, 0,7/3 prolina ditambah Hyp, dan 1,3/3 asam amino lainnya (Li & Wu, 2018).

Histologi Kulit Tuna Sirip Kuning Berdasarkan histologi dengan pewarnaan pada kulit sebelum pretreatment serat kolagen berwarna merah disertai garis berwarna hitam yang merupakan lemak yang ada pada kulit. Jika dibandingkan pada kulit sebelum pretratment, serat kolagen setelah proses pretreatment menunjukkan distribusi longgar disebabkan oleh pembengkakan yang dipicu oleh perendaman dalam larutan alkali dan penghilangan protein serta lemak non-kolagen. Hasil ini menunjukkan bahwa setelah pretreatment, serat kulit ikan membengkak dan zat non-kolagen terbuang, sehingga menghasilkan isolasi kolagen dengan rendemen dan kemurnian yang lebih tinggi (Xu et al., 2017). Konsentrasi asam asetat sangat memengaruhi hasil, titik leleh, dan mikrostruktur kolagen kulit tuna. Konsentrasi asam asetat yang rendah, mengasilkan serat kolagen tipis dengan banyak lubang, menunjukkan jaringan yang lebih berpori dan longgar, sedangkan pada perlakuan asam asetat yang lebih tinggi, terbentuk serat tebal dan padat, menunjukkan agregat kolagen yang lebih kompak setelah perlakuan asam yang lebih tinggi (Pezeshk et al., 2022). Ketampakan histologi kulit sebelum dan sesudah pretreatment disajikan pada Figure 2.

Hidrolisat kolagen adalah produk kaya protein yang berasal dari pemecahan kolagen asli secara enzimatik atau kimiawi, menghasilkan peptida yang lebih kecil dan mudah diserap tubuh. Konsentrasi proteinnya bervariasi tergantung pada sumber, metode pengolahan, dan tujuan penggunaan, tetapi umumnya tinggi, yang dapat dimanfaatkan untuk industri pangan, nutrasetikal, dan kosmetik.

Konsentrasi protein hidrolisat ditunjukan pada Figure 3, menunjukkan perbedaan aktivitas enzim menghasilkan nilai konsentrasi protein yang berbeda. Konsentrasi protein yang diperoleh pada tiap perlakuan suhu dan aktivitas enzim berkisar pada rentang 1,7-1,8 mg/mL. Sampel kulit yang dihidrolisis dengan aktivitas enzim 6.000 U memiliki nilai konsentrasi protein yang lebih kecil dibandingkan dengan perlakuan 9.000 U dan 12.000 U. Perlakuan suhu juga menghasilkan perbedaan nyata pada konsentrasi protein yang dihasilkan (p<0,05), namun interaksi antara aktivitas enzim dan suhu pada proses hidrolisis tidak memiliki pengaruh nyata pada konsentrasi protein yang dihasilkan (p>0,05). Nilai konsentrasi protein sendiri dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu bahan baku (Gaspardi et al., 2022); metode hidrolisis yang digunakan mencakup jenis enzim, pH, suhu dan waktu hidrolisis (Leon-lopez et al., 2019). Konsentrasi protein dalam hidrolisat biasanya meningkat seiring dengan suhu hingga mencapai optimum spesifik enzim, kemudian menurun ketika enzim dinonaktifkan oleh panas atau protein mengalami agregasi.

Derajat hidrolisis (DH) mengukur sejauh mana ikatan peptida dalam kolagen terputus selama hidrolisis. DH yang lebih tinggi umumnya menghasilkan peptida yang lebih kecil, yang dapat meningkatkan kelarutan, aktivitas biologis, dan bioavailabilitas.

Derajat hidrolisis yang diperoleh pada tiap perlakuan hidrolisis yang ditunjukan pada Figure 4, memiliki nilai yang beragam tiap perlakuannya. Derajat hidrolisis paling tinggi diperoleh perlakuan aktivitas enzim 9.000 U pada suhu 50ºC sebesar 57,4±0,45%.

Perlakuan aktivitas enzim, suhu dan interaksi antara keduanya memberikan pengaruh nyata terhadap derajat hidrolisis yang dihasilkan (p<0,05). Derajat hidrolisis yang dihasilkan pada penelitian ini dengan enzim pepsin memiliki nilai yang lebih besar jikan dibandingkan dengan penelitian (S. et al., 2017) dan (A. & A, 2021), masing masing memperoleh nilai derajat hidrolis 11% dan 19%. Nilai DH yang berbeda pada penelitian dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu waktu hidrolisis, konsentrasi dan aktivitas enzim, serta suhu. Penggunaan kombinasi enzim (misalnya, kolagenase + tripsin) atau kondisi optimum (misalnya, pH dan suhu) dapat menghasilkan DH yang lebih tinggi, seringkali di atas 24–37% dalam waktu 30–90 menit, hingga 60% dengan metode enzimatik tertentu (Hema et al., 2017).

Pola elektroforesis protein hidrolisat pada SDS-PAGE diilustrasikan pada Figure 5. Marker Protein standar dengan rentang berat molekul (10-250 kD) digunakan untuk menentukan bobot molekul hidrolisat. Pita protein yang ditunjukan pada hasil elektroforesis menghasilakan bobot molekul pada rentang 15-250 kDa. Pita protein yang paling mencolok dihasilkan pada bobot molekul 20 dan 25 kDa. Hasil dalam penelitian ini bobot molekul yang diasilkan masih banyak berada >100 kDa yang mengartikan bahwa proses hidrolisis masih belum sepenuhnya selesai selaras dengan derjat hidrolisis yang dihasilkan.

(Pezeshk et al., 2022) melaporkan hidrolisis kolagen dengan pepsin yang diisolasi dari kulit ikan mas perak menghasilkan pita peptida dengan bobot molekul 70-15 kDa. Hidrolisis protein sangat dipengaruhi oleh jenis dan konsentrasi enzim. Aktivitas enzim serta suhu yang digunakan juga akan mempengaruhi proses hidrolisis (Kezwon et al., 2016). Peptida dengan berat molekul rendah (biasanya <1–3 kDa, seringkali beberapa hingga 20 asam amino) cenderung menunjukkan bioaktivitas terkuat, karena penyerapan dan penetrasi seluler yang lebih baik. Terkadang bobot molekul menengah (misalnya 5–10 kDa) memberikan kapasitas antioksidan terbaik, sementara peptida yang lebih kecil lagi mengoptimalkan sifat pengemulsi/pengikatan lemak, menunjukkan bahwa berat molekul ideal dapat spesifik fungsi (J. et al., 2022). Namun, peptida dengan berat molekul relatif besar (>10 kDa) juga dapat menunjukkan aktivitas antioksidan, antihipertensi, dan bioaktivitas lainnya.

Nilai IC50 yang makin kecil akan memberikan aktivitas antioksidan yang makin baik karena dibutuhkan lebih sedikit konsentrasi sampel untuk menghambat radikal bebas sebanyak 50%. Senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat saat memiliki nilai IC50 <50ppm, kuat bila pada rentang 50-100 ppm, sedang pada rentang 100-150 ppm, 150-200 ppm tergolong lemah dan sangat lemah apabila memiliki nilai lebih dari 200 ppm (Molyneux 2004). Nilai IC50 yang diperoleh berbeda tiap perlakuan sampel, nilai IC50 yang paling rendah diperoleh sampel dengan perlakuan 9.000 U suhu 50ºC dengan nilai 59±2,49 ppm pada ABTS dan perlakuan 9.000 U suhu 40ºC dengan nilai 194±22,17 ppm pada DPPH. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perbedaan aktivitas pepsin dan suhu yang diberikan selama proses hidrolisis memberikan pengaruh nyata (p<0,05) terhadap aktivitas antioksidan hidrolisat kolagen kulit tuna (Table 4).

(M. et al., 2020) menggunakan sampel kulit tuna sirip kuning memproleh nilai yang IC50 sebesar 66,28±0,12 µg/mL untuk ABTS dan 119,10±0,01 µg/mL untuk DPPH. Selanjutnya (M. et al., 2020) melaporkan kemampuan hidrolisat dalam mereduksi oksidator ABTS (>80%) lebih baik dibandingkan oksidator DPPH (5,79%) pada konsentrasi 1 mg/mL protein hidrolisat. Uji ABTS maupun DPPH secara konsisten menunjukkan bahwa kolagen kulit ikan yang dihidrolisis menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan, meskipun hasilnya dapat bervariasi berdasarkan spesies, enzim yang digunakan, dan ukuran peptida. Umumnya, hidrolisis meningkatkan kapasitas antioksidan, peptida dengan berat molekul lebih rendah (<3–10 kDa) menunjukkan aktivitas tertinggi pada kedua uji tersebut. ABTS seringkali mendeteksi aktivitas antioksidan yang lebih tinggi daripada DPPH, kemungkinan karena kemampuannya untuk mengukur senyawa hidrofilik dan lipofilik, sementara DPPH lebih cocok untuk antioksidan hidrofobik (Rumpf et al., 2023). Kapasitas antioksidan meningkat seiring dengan berlangsungnya hidrolisis hingga mencapai titik optimum, tetapi hidrolisis lebih lanjut atau hanya menggunakan kondisi yang “lebih aktif” dapat mengurangi atau mencapai titik jenuh aktivitas. Efek antioksidan bergantung pada struktur dan ukuran peptida, bukan hanya dari aktivitas enzim yang digunakan (Mahdavi-Yekta et al., 2019).

Angiotensin converting enzime (ACE) memainkan peranan penting dalam regulasi tekanan darah. ACE mengkonversi angiotensin I menjadi vasokonstriktor kuat angiotensin II. Semakin tinggi aktivitas inhibitor ACE maka semakin rendah konsentrasi asam hipurat yang terbentuk (Ahmad et al. 2017). Konsentrasi sampel yang digunakan sebesar 1,7 mg/mL protein dalam pengujian ini. Hasil pengujian aktivitas ACE inhibitor disajikan pada Figure 6.

Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perbedaan aktivitas pepsin dan suhu hidrolisis yang digunakan memberikan pengaruh yang nyata (p<0,05) terhadap aktivitas penghambatan ACE (Figure 6). Hasil inhibisi yang paling baik ditunjukan pada perlakuan enzim 9.000 U pada suhu 50ºC, dimana hasil aktivitas inhibitor ACE 66±0,93%, pada konsentrasi 1,7 mg/mL protein. Hidrolisat kolagen dari teripang yang dilaporkan oleh (H. et al., 2015), memperoleh aktivitas inhibitor ACE sebesar 82,31% dengan perlakuan hidrolisis 180 menit pada konsentrasi 15 mg/mL. Hasil penelitian yang diperoleh menghasilkan nilai yang cukup tinggan karena konsentrasi yang diperlukan untuk mencapai nilai IC50 lebih sedikit jika dibandingkan dengan penelitian (H. et al., 2015). Penggunaan jenis enzim yang berbeda juga akan menghasilkan peptida bioaktif serta kemampuan inhibisi yang berbeda pula. Hidrolisat kolagen dari gelembung renang monkfish yang dilaporkan oleh (D. et al., 2023), memperoleh aktivitas inhibitor ACE sebesar 53,22±2,63% dengan hidirolisis enzimatik alkalase + neutrase pada konsentrasi 2,5 mg/mL. Alkalase adalah protease basa yang sering digunakan untuk pembangkitan peptida bioaktif dengan aktivitas penghambatan ACE.