Caulerpa racemosa segar dibersihkan dari kotoran, dicuci dengan air laut dan air destilata. Sampel dikeringkan menggunakan oven (Memmert) dengan suhu selama 12 jam hingga kadar air mencapai <10%, kemudian digiling menjadi dengan mortal dan selanjutnya diblender sampai menjadi serbuk halus (Djapiala et al., 2013).

Proses ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi pada suhu ruang untuk memaksimalkan difusi senyawa bioaktif. Sampel serbuk C. racemosa (50 g) direndam dalam 500 mL pelarut metanol (A1) dan etil Asetat (A2) (MERCK) selama 3x24 jam. Penggunaan dua jenis pelarut berbeda polaritas ini bertujuan untuk mengekstrak spektrum senyawa yang lebih luas. Perlakuan ekstraksi dilakukan secara bertingkat pada konsentrasi 35% (B1), 55% (B2), 75% (B3), dan 95% (B4) dan untuk mengidentifikasi pelarut optimal. Filtrat yang dihasilkan dipekatkan menggunakan rotary evaporator (BUCHI) pada suhu untuk metanol dan untuk etil asetat, sesuai dengan titik didih masing-masing pelarut, sehingga diperoleh ekstrak kental (Azwanida, 2015). Semua bahan kering diukur menggunakan timbangan analitik (Ohaus), dan peralatan gelas yang digunakan adalah kelas Pyrex.

Ekstrak C. racemosa diuji kandungan fitokimianya meliputi flavonoid, alkaloid, saponin, fenolik, tanin, terpenoid, dan steroid menggunakan metode standar. Proses identifikasi metabolit sekunder dilakukan melalui analisis fitokimia kualitatif yang didasarkan pada indikator reaksi warna serta terbentuknya endapan (Harborne, 1998). Uji flavonoid menggunakan 1mg ekstrak ditambahkan 1 mg serbuk Mg (Smartlab) dan 2 mL HCl (Merck) pekat, kemudian dikocok. Uji positif ditunjukkan oleh terbentuknya warna merah, kuning atau jingga (Robinson, 1995).

Identifikasi alkaloid dilakukan dengan cara 2 g ekstrak ditambahkan dengan 1 mL HCl 2 N dan 6 mL air suling, kemudian dipanaskan selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat diperiksa dengan pereaksi mayer terbentuk endapan putih (Harborne, 1998). Uji saponin dilakukan dengan menyiapkan 2 g ekstrak ditambahkan air panas, kemudian ditambahkan beberapa tetes HCl pekat. Uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya busa permanen ±15 menit (Harborne, 1998). Uji fenolik menggunakan beberapa tetes FeCl 1% (Merck) yang ditambahkan pada 2 g ekstrak sampel. Uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru kehitaman (Saxena et al., 2013). Uji tanin, 0,5 g ekstrak ditambahkan aquades sampai terendam, kemudian dipanaskan selama 3 sampai 5 menit, selanjutnya tambahkan 2 tetes larutan NaCl 10% lalu direaksikan dengan menambahkan 2 tetes Terbentuknya warna biru kehitaman menunjukan adanya kandungan tanin (Robinson, 1995). Uji terpenoid, masukkan 2 g ekstrak, tambahkan 2 mL kloroform (Smartlab) dan 2 mL HCl (Merck). Uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau tua (Robinson, 1995). Uji steroid, 2 g ekstrak ditambahkan asetat anhidrat (Merck) 10 tetes dan 3 tetes (Merck). Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau biru (Robinson, 1995). Uji fitokimia menggunakan alat gelas yakni tabung reaksi, pipet dan tabung erlenmeyer (Pyrex)

Isolat bakteri C. acnes ATCC 6916 dan S. aureus ATCC 6538 diremajakan pada media nutrien agar (MERCK), diinkubasi di dalam inkubator (MEMMERT) selama 24 jam pada suhu 37°C. Pembuatan media dan penggunaan alat gelas seperti cawan petri (ANUMBRA), tabung erlenmeyer 250 dan 500 mL, tabung reaksi, gelas ukur 250 mL (Pyrex), dan disterilisasi menggunakan autoclave (Tommy). Media ditimbang menggunakan timbangan analitik (Ohaus) dan dimasak menggunakan hot plate (Boico). Semua pengerjaan dilakukan di dalam laminar air flow (HLM120) (Daud et al., 2023). Koloni tunggal yang tumbuh setelah bakteri diinkubasi dipindahkan ke media NaCl (Ficher Chemical) dan diinkubasi hingga mencapai kekeruhan setara dengan standar McFarland 0,5 (1,5×10⁸ CFU/mL) (Huang, 2020).

Uji aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode difusi cakram Kirby-Bauer (Hudzicki, 2009). Suspensi bakteri disebarkan secara merata pada permukaan media nutrient agar menggunakan swab steril. Blank Disc (MN Germany) berdiameter 6 mm dijenuhkan dengan 20 μL ekstrak uji, diletakkan pada permukaan media agar yang telah diinokulasi bakteri. Diameter zona hambat diukur menggunakan jangka sorong dengan akurasi pengukuran 0,1 mm. Zona hambat yang terbentuk dikategorikan berdasarkan kriteria Davis & Stout (1971): sangat kuat (>20 mm), kuat (15-20 mm), sedang (10-15 mm), lemah (5-10 mm), dan tidak aktif (<5 mm).

Disk antibiotik eritromisin (Oxoid) digunakan sebagai kontrol positif, sedangkan kontrol negatif berupa pelarut tanpa tambahan ekstrak. Proses homogenisasi konsentrasi ekstrak yang akan diuji dilakukan menggunakan alat vortex (Heidolph), sedangkan pemipetan larutan dilakukan dengan mikropipet berkapasitas 200 µl dan 1.000 µl (Eppendorf). Setiap perlakuan diulang empat kali. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Alenezi, 2023).

Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial, perlakuan yang diberikan dalam percobaan ini adalah jenis pelarut (A1=metanol dan A2=etil asetat) dan konsentrasi ekstrak (B1=35%, B2=55%, B3=75% dan B4=95%). Setiap perlakuan diulang sebanyak empat (4) kali. Sebelum dilakukan analisis varians, terlebih dahulu dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Analisis varians (ANOVA) digunakan untuk mengolah data zona hambat setiap bakteri uji, kemudian perlakuan yang berpengaruh nyata dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) pada tingkat signifikansi 5% (Lusiana & Mahmudi, 2021).

Proses ekstraksi C. racemosa menggunakan metode maserasi (Rahman et al., 2019), pelarut yang digunakan adalah metanol dan etil asetat dengan berbagai konsentrasi. Ekstrak yang dihasilkan adalah 20 g ekstrak metanol kental berwarna hijau tua dengan rendemen 33,3 %, dan 15 g ekstrak etil asetat dengan tekstur yang sama berwarna hijau tua dengan rendemen 25% (Table 1). Rendemen ekstrak metanol C. racemosa hasil penelitian Marraskuranto et al. (2021) sebanyak 4,24%, sedangkan hasil penelitian Marfuah et al. (2018) melaporkan bahwa rendemen ekstrak etanol sebanyak 2,18%.

Hasil uji fitokimia (Table 2) menunjukkan bahwa ekstrak metanol C. racemosa mampu mengekstraksi flavonoid dan alkaloid yang bersifat polar, sedangkan ekstrak etil asetat tidak mendeteksi keduanya. Kedua pelarut sama-sama mengekstraksi saponin, fenolik, tanin, terpenoid, dan steroid. Hasil ini menegaskan bahwa metanol lebih efektif untuk senyawa polar, sementara etil asetat lebih optimal mengekstraksi senyawa semipolar atau nonpolar.

Berdasarkan hasil uji fitokimia, ekstrak metanol C. racemosa terdeteksi mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, saponin, fenolik, tanin, terpenoid, serta steroid. Hasil ini sejalan dengan penelitian Marraskuranto et al. (2021) yang melaporkan keberadaan senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, fenolik, dan steroid pada C. racemosa yang diekstraksi dengan pelarut metanol, etil asetat dan heksana. Senyawa-senyawa tersebut telah dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri melalui berbagai mekanisme. Flavonoid dapat menghambat sintesis asam nukleat, mengganggu fungsi membran sel, dan menghambat metabolisme energi bakteri (Gorniak et al., 2019). Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan kelompok senyawa antimikrob utama dalam alga hijau yang bekerja melalui mekanisme denaturasi protein dan gangguan permeabilitas membran sel bakteri (Kumar & Goel, 2019). Fakta ini sejalan dengan laporan Setha et al. (2024) yang menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat daun Jatropha curcas mampu menghambat bakteri pembentuk histamin melalui kerusakan membran sel. Kandungan fenol total dalam C. racemosa dilaporkan berkisar 2,5–4,8 mg GAE/g ekstrak kering (Palaniyappan et al., 2023).

Senyawa alkaloid tergolong nitrogen heterosiklik dan bersifat antimikrob melalui mekanisme interferensi terhadap sintesis DNA dan RNA bakteri. Mekanisme kerja alkaloid melibatkan gangguan terhadap komponen penyusun peptidoglikan, menyebabkan dinding sel bakteri gagal terbentuk secara utuh (Nourbakhsh et al., 2022). Saponin merupakan senyawa glikosida triterpena yang memiliki kemampuan untuk merusak membran sel bakteri melalui interaksi dengan sterol dan fosfolipid membran. Saponin dalam Caulerpa racemosa dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri yang sinergis dengan senyawa fenol (Palaniyappan et al., 2023). Saponin bekerja dengan cara meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri sehingga terjadi hemolisis sel (Groot & Muller-Goymann, 2016).

Tanin merupakan Senyawa polifenol yang dapat membentuk kompleks dengan protein dinding sel bakteri, menyebabkan denaturasi dan lisis sel. Tanin dapat menginhibisi enzim yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri (Sharma, 2019). Tanin memiliki aktivitas antibakteri melalui penghambatan enzim reverse transkriptase dan DNA topoisomerase serta merusak membran sel bakteri (Brighenti et al., 2021). Senyawa terpenoid termasuk monoterpena, sesquiterpena, dan diterpena yang memiliki aktivitas antimikrob melalui gangguan membran sel dan inhibisi enzim respirasi bakteri (Guimaraes et al., 2019). Mekanisme kerja terpenoid dan steroid melibatkan interaksi dengan protein transmembran pada membran luar sel bakteri yang membentuk kompleks polimer kuat yang akhirnya merusak fungsi purin (Kumar & Engle, 2023). Interaksi sinergis antara senyawa-senyawa bioaktif ini berkontribusi terhadap aktivitas antimikrob yang diamati dalam penelitian. Ekstrak metanol menunjukkan aktivitas antimikrob paling kuat, diperkirakan mengandung kombinasi senyawa bioaktif dalam proporsi yang optimal.

Data diameter zona hambat bakteri C. acnes yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar 8.00-18.00 mm. Rataan diameter zona hambat bakteri C. acnes pada perlakuan jenis pelarut metanol (12,63 mm) ternyata lebih besar dibandingkan dengan perlakuan jenis pelarut etil asetat (11,75 mm). Diameter zona hambat kontrol positif (antibiotik eritromisin) sebesar 19.00±1.00 mm.

Berdasarkan analisis keragaman, perlakuan jenis pelarut (A) dan konsentrasi ekstrak (B) terbukti berpengaruh sangat signifikan terhadap zona hambat bakteri C. acnes, sedangkan interaksi antara kedua perlakuan jenis pelarut dan konsentrasi ekstrak (AB) tidak berpengaruh nyata. Hasil uji beda nyata jujur (Table 3) menunjukkan bahwa rataan zona hambat bakteri C. acnes pada perlakuan konsentrasi ekstrak 35% berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi ekstrak 55%, 75%, dan 95%, perlakuan konsentrasi ekstrak 55% berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi ekstrak 75% dan 95%, perlakuan konsentrasi ekstrak 75% berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi ekstrak 95%. Berdasarkan hasil Uji BNJ tersebut, konsentrasi ekstrak 95% yang terbaik dalam menghambat pertumbuhan bakteri C. acnes.

Aktivitas antibakteri ekstrak C. racemosa terhadap bakteri C. acnes dan S. aureus meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak yang diberikan. Temuan ini konsisten dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan bahwa C. racemosa memiliki senyawa bioaktif yang dapat mendukung kesehatan kulit dan berpotensi dikembangkan dalam formulasi kosmetik (Viruly et al., 2024). Mekanisme antibakterinya diduga berasal dari metabolit sekunder seperti flavonoid, fenolik, tanin, dan terpenoid yang mampu merusak dinding sel serta menghambat sintesis protein bakteri. Rataan zona hambat pada pelarut metanol (12,63 mm) lebih tinggi dibandingkan dengan etil asetat (11,75 mm), yang mengindikasikan bahwa senyawa polar lebih banyak terlarut dalam metanol. Temuan ini sesuai dengan penelitian Palaniyappan et al. (2023) yang menunjukkan bahwa ekstrak metanol C. racemosa memiliki kandungan fenolik dan flavonoid yang lebih tinggi dibandingkan pelarut semipolar, sehingga memberikan aktivitas antibakteri lebih kuat. Rushdi et al. (2020) menyebutkan bahwa genus Caulerpa mengandung metabolit sekunder seperti caulerpin, fenolik, dan flavonoid, yang larut optimal dalam pelarut polar sehingga menghasilkan potensi farmakologis yang lebih signifikan. Dengan demikian, hasil penelitian ini menegaskan bahwa polaritas pelarut merupakan faktor kunci yang memengaruhi aktivitas antibakteri ekstrak C. racemosa.

Pola peningkatan daya hambat seiring konsentrasi (35%<55%<75%<95%) menunjukkan hubungan dosis–respon yang kuat. Analisis BNJ memperlihatkan bahwa setiap konsentrasi berbeda nyata satu sama lain pada taraf 5%, yang menandakan bahwa kenaikan konsentrasi berbanding lurus dengan luas zona hambat. Belkacemi et al. (2020) melaporkan bahwa fraksi polifenolik C. racemosa memperlihatkan aktivitas antibakteri meningkat seiring konsentrasi dan fraksionasi. El-Sapagh et al. (2023) melaporkan bahwa ekstrak C. racemosa memperlihatkan aktivitas antimikrob dan antibiofilm yang signifikan pada konsentrasi tinggi, sehingga memperkuat indikasi adanya efek yang bergantung pada dosis. Temuan ini didukung oleh kajian fitokimia yang menunjukkan bahwa polifenol dan tanin dalam makroalga mampu merusak membran sel bakteri, mengganggu transport ion, dan menurunkan aktivitas enzim (Belkacemi et al., 2020; Palaniyappan et al., 2023). Dengan demikian, peningkatan konsentrasi ekstrak berimplikasi langsung pada peningkatan efektivitas antimikrob.

Berdasarkan sudut pandang klinis, hasil penelitian ini sangat relevan karena resistansi antibiotik C. acnes cenderung meningkat. Beig et al. (2024) dan Legiawati et al. (2023) menegaskan adanya peningkatan resistansi terhadap antibiotik lini pertama jerawat seperti klindamisin, makrolida, dan tetrasiklin. Fakta ini menuntut alternatif terapi yang lebih aman dan efektif, salah satunya melalui pemanfaatan metabolit bioaktif dari makroalga laut. Ekstrak metanol C. racemosa yang menunjukkan aktivitas antibakteri signifikan terhadap C. acnes berpotensi dikembangkan sebagai kandidat bahan aktif topikal anti-jerawat. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk melakukan fraksionasi senyawa aktif, menguji efek antibiofilm pada C. acnes, serta mengevaluasi keamanan melalui uji sitotoksisitas pada sel kulit (keratinosit dan sebosit). Strategi tersebut membuka peluang lebih luas bagi translasi Caulerpa racemosa menjadi sediaan farmasi (Rushdi et al., 2020).

Data diameter zona hambat bakteri S. aureus yang diperoleh dalam penelitian ini berkisar 9.00-16.00 mm. Rataan diameter zona hambat bakteri S. aureus pada perlakuan jenis pelarut metanol (12,94 mm) ternyata lebih besar dibandingkan dengan perlakuan jenis pelarut etil asetat (11,00 mm). Diameter zona hambat kontrol positif (antibiotik eritromisin) sebesar 19,00±1,00 mm.

Hasil analisis keragaman menunjukkan bahwa perlakuan jenis pelarut (A) dan konsentrasi ekstrak (B) berpengaruh sangat nyata terhadap zona hambat bakteri S. aureus, sedangkan interaksi antara kedua perlakuan jenis pelarut dan konsentrasi ekstrak (AB) tidak berpengaruh nyata. Hasil uji beda nyata jujur (Table 4) menunjukkan bahwa rataan zona hambat bakteri S. aureus pada perlakuan konsentrasi ekstrak 35% tidak berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi ekstrak 55%, namun berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi ekstrak 75% dan 95%. Perlakuan konsentrasi ekstrak 55% berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi ekstrak 75% dan 95%, perlakuan konsentrasi ekstrak 75% berbeda nyata terhadap perlakuan konsentrasi ekstrak 95%. Berdasarkan hasil uji BNJ, konsentrasi ekstrak 95% yang terbaik dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus.

Ekstrak metanol menunjukkan ratarata zona hambat lebih besar terhadap S. aureus (12,94 mm) dibandingkan etil asetat (11,00 mm). Hasil penelitian Belkacemi et al. (2020), melaporkan bahwa ekstrak metanol C. racemosa mengandung jumlah senyawa bioaktif lebih banyak (29 senyawa) dibanding pelarut lain, termasuk senyawa antimikrob seperti tetrazole, dan derivatif asam lemak antimikrob. Kandungan metabolit dalam metanol ini berkontribusi terhadap efek daya hambat bakteri S. aureus.

Senyawa bioaktif polar seperti fenolik, flavonoid, dan tanin lebih banyak diekstraksi oleh metanol dibandingkan etil asetat. Kandungan fenolik dan flavonoid dalam ekstrak C. racemosa yang diperoleh dengan pelarut polar berperan penting dalam menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif seperti S. aureus(Palaniyappan et al., 2023). Mekanisme kerjanya terutama melalui perusakan membran sel bakteri, denaturasi protein, serta gangguan metabolisme energi (Yap et al., 2019). Temuan ini sejalan dengan Fernandes et al. (2025) yang melaporkan bahwa ekstrak C. racemosa menunjukkan aktivitas antibakteri dan antibiofilm signifikan terhadap beberapa strain patogen, termasuk S. aureus, dengan daya hambat lebih tinggi pada pelarut polar.

Hasil uji BNJ mengungkapkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara konsentrasi 35 % dan 55%. Nilai zona hambat keduanya lebih kecil dari pada konsentrasi 75% (13,12 mm) berbeda nyata terhadap konsentrasi 95% (14,12 mm). Ekstrak metanol C. racemosa memiliki zona hambat terhadap bakteri S. aureus sebesar 7,32 mm (Ritan et al., 2021), sedangkan ekstrak etanol C. racemosa dengan konsentrasi 50% dan 75% menghasilkan zona hambat terhadap bakteri S. aureus sebesar 20,00 mm dan 22,00 mm (Pattipeilohy et al., 2023).

Pola ini konsisten dengan efek dosis respon terstandar, di mana konsentrasi tinggi menghasilkan zona hambat lebih besar. Zainuddin et al. (2019) melaporkan bahwa ekstrak metanol C. racemosa menunjukkan aktivitas antibakteri tinggi terhadap bakteri patogen, termasuk S. aureus, dengan pelarut metanol menghasilkan efek antibakteri tertinggi dibandingkan pelarut lain. Zubia et al. (2020) melaporkan bahwa metabolit sekunder Caulerpa seperti caulerpin dan caulerpenyne bersifat dose-dependent dalam aktivitas antimikrob. Kondisi ini terjadi karena akumulasi senyawa bioaktif pada konsentrasi tinggi mampu meningkatkan permeabilitas membran bakteri, sehingga mempercepat lisis sel.

Hasil penelitian ini memiliki relevansi penting dalam konteks resistansi antibiotik pada S. aureus. Bakteri ini dikenal sebagai patogen oportunistik yang sering menunjukkan resistansi terhadap berbagai antibiotik, termasuk metisilin dan oksasilin, yang memunculkan strain methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Guo et al. (2020) menegaskan peningkatan prevalensi resistansi antibiotik pada S. aureus, sehingga pencarian alternatif terapi berbasis metabolit alami semakin mendesak. C. racemosa memiliki potensi sebagai sumber kandidat antimikrob baru yang efektif terhadap S. aureus, sekaligus aman digunakan sebagai bahan aktif topikal. Sejalan dengan temuan Abebe & Birhanu (2023), yang menyatakan bahwa pemanfaatan metabolit makroalga dapat menjadi strategi farmakologis untuk menghadapi krisis resistansi antimikrob global. Oleh karena itu, hasil penelitian ini memperkuat bukti bahwa ekstrak C. racemosa, khususnya menggunakan pelarut metanol dan pada konsentrasi tinggi, memiliki prospek sebagai agen fitofarmaka anti-S. aureus.