Data sekuens DNA dari National Center of Biotechnology Information (NCBI) digunakan sebagai dasar dalam desain primer ikan sapu-sapu dengan dukungan software BioEdit dan SnapGene. Target primer DNA ikan sapu-sapu tertuju pada daerah Displacement Loop (D-Loop) di DNA mitokondria. Primer spesifik untuk ikan sapu-sapu menggunakan primer yang diambil dari urutan DNA spesies Pterygoplichthys pardalis. Urutan basa dari primer yang sudah di desain untuk primer forward adalah 5‘GCCAAGGCATTCTTTCACG’3 dan primer reverse adalah 5’ CCCTGCGGGAAGCACTTG’ 3.

Sumber DNA berupa sampel daging ikan (sapu-sapu, nila, mujair, tongkol, gurame, tenggiri, patin, makarel, kembung dan lele) serta pempek. Pempek yang digunakan sebanyak 16 sampel. Sampel pempek dibeli dari pedagang kaki lima di sekitar stasiun kereta api provinsi DKI Jakarta (Barat, Timur, Utara, Pusat, dan Selatan) pada bulan Agustus sampai September 2024. Sampel ikan nila, mujair, tongkol, gurame, tenggiri, patin, makarel, kembung dan lele diperoleh dari supermarket, sedangkan ikan sapusapu diperoleh dari Sungai Ciliwung, Jakarta Timur (6°13’29,4”S106°51’49,8”E). Sampel daging ikan yang digunakan berupa daging utuh tanpa tulang dan duri pada bagian tubuh. Sampel daging ikan dan pempek selanjutnya ditimbang dan diisolasi DNA total menggunakan DNeasy mericon food kit (Qiagen).

Uji selektivitas primer dilakukan dengan cara membandingkan kurva amplifikasi yang muncul saat proses PCR. Uji selektivitas primer dianggap berhasil jika kurva amplifikasi hanya muncul pada sampel DNA ikan sapu-sapu sedangkan pada sampel DNA ikan yang lain (nila, mujair, tongkol, gurame, tenggiri, patin, makarel, kembung dan lele) tidak muncul. Selain itu pada kurva Tm (temperature melting) hanya menunjukkan 1 puncak saja khususnya pada sampel DNA ikan sapu-sapu sedangkan pada sampel DNA ikan lain tidak menunjukkan adanya kurva Tm. Uji selektivitas merujuk pada Wahyuni et al. (2019) dan Suseno & Razari (2023) dengan beberapa modifikasi.

Uji sensitivitas primer dilakukan dengan dua cara. Cara pertama dengan melakukan seri pengenceran DNA ikan sapusapu (kurva standar). Pengenceran dibuat dengan tujuh deret konsentrasi dengan seri pengenceran 5 kali (10 ng/µL; 2 ng/µL; 0,4 ng/µL; 0,08 ng/µL; 0,016 ng/µL; 0,0032 ng/µL; 0,00064 ng/µL). Cara ke dua dilakukan dengan membuat pempek yang ditambahkan daging ikan sapu-sapu dengan perbandingan tertentu. Pempek dibuat dengan mencampurkan bahan dasar, yaitu tepung tapioka, bawang putih dan air serta daging ikan sapu-sapu. Perbandingan antara bahan dasar pembuatan pempek (tepung tapioka, bawang putih dan air) dengan daging ikan sapu-sapu yaitu 1:1, 5:1, 10:1, dan 20:1 (b/b). Uji sensitivitas merujuk pada Wahyuni et al. (2019) dan Suseno & Razari (2023) dengan beberapa modifikasi.

Amplifikasi fragmen DNA spesifik dilakukan dengan metode RT-PCR. Komponen reaksi yang digunakan sebanyak 25 μL yang terdiri atas master mix PCR 12,5 μL, primer forward 0,75 μL, primer reverse 0,75 μL, nuclease free water 7,8 μL, EvaGreen sebanyak 1,2 μL dan 2 μL template DNA dengan konsentrasi 10 ng/ μL. Proses amplifikasi dijalankan pada PCR System dengan kondisi denaturasi awal pada suhu 95oC selama 180 detik, 44 siklus yang terdiri atas denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 60oC selama 30 detik dan pemanjangan DNA baru pada suhu 72oC selama 30 detik. Adanya DNA ikan sapu-sapu pada sampel akan ditunjukkan dengan adanya kurva amplifikasi berbentuk sigmoid.

Desain Primer DNA ikan sapu-sapu menggunakan daerah D-Loop pada DNA mitokondria dari ikan sapu-sapu spesies P. pardalis yang memiliki panjang 785 pb. Panjang produk DNA yang dihasilkan dari primer yang digunakan yaitu 83 pb. Daerah D-loop atau yang dikenal dengan control region adalah salah satu segmen DNA yang memiliki proses replikasi dan transkripsi DNA mitokondria dengan tingkat mutasi dan laju polimorfisme yang tinggi, sehingga menyebabkan urutan nukleotida yang sangat bervariasi antar individu (Ningsih et al., 2021). Oleh sebab itu, desain primer menggunakan D-loop diharapkan mampu membedakan spesies ikan sapu-sapu dengan spesies ikan lainnya yang biasa digunakan sebagai bahan baku pembuatan pempek.

Sungai Ciliwung terdapat tiga spesies ikan sapu-sapu (Pterygoplichthys sp.) bila dianalisis berdasarkan pola kepala dan abdomennya yaitu P. pardalis, P. disjunctivus dan hibrida. Hasil identifikasi berdasarkan pola kepala menunjukkan bahwa spesies P. pardalis mendominasi sebanyak 76% bila dibandingkan dengan spesies ikan sapu-sapu lainnya di Sungai Ciliwung (Elfidasari et al., 2019). Ikan sapu-sapu spesies P. pardalis merupakan salah satu ikan invasif yang paling banyak ditemukan di Sungai Ciliwung (Ainy et al., 2024). Oleh sebab itu desain primer ini mengacu pada template DNA ikan sapu-sapu spesies P. pardalis.

Nilai per.ident sebesar 100% menunjukkan kesesuaian penuh antara sekuens primer yang digunakan dengan data DNA spesies tertentu pada basis data NCBI. Nilai per.ident yang semakin besar menunjukkan tingkat kesesuaian sekuens yang semakin tinggi (Suseno & Razari, 2023). Hasil analisis BLAST pada situs NCBI menunjukkan bahwa desain primer memiliki nilai per.ident 100% terhadap sekuens DNA spesies P. pardalis dan beberapa jenis ikan sapu-sapu dari genus Hypostomus seperti Hypostomus plecostomus dan Hypostomus sp. Selain ikan sapu-sapu dari genus Pterygoplichthys yang hidup dominan di Sungai Ciliwung, beberapa penelitian menunjukkan bahwa genus Hypostomus juga di temukan di beberapa Sungai di Indonesia (Pramono et al., 2018, Desrita et al., 2020, Asnawi, 2023). Data Multiple Sequence Alignment (MSA) menunjukkan bahwa primer forward dan reverse yang digunakan memiliki banyak kesamaan urutan dengan DNA ikan sapu-sapu spesies Pterygoplichthys pardalis, Hypostomus Plecostomus dan Hypostomus sp (Figure 1) sehingga memungkinkan primer untuk menempel dengan baik pada sekuen DNA target.

Sampel pempek yang digunakan dalam penelitian sebanyak 16 sampel, sedangkan sampel ikan yang digunakan sebanyak 10 jenis ikan. Pempek dibuat dengan bahan dasar berupa karbohidrat yaitu tepung tapioka. Tingginya kadar karbohidrat dalam sampel pempek merupakan suatu hambatan dalam mengekstraksi DNA ikan yang kemungkinan terkandung di dalamnya. Jika ekstraksi tidak dilakukan dengan hati-hati maka pengotor berupa karbohidrat dapat terbawa sehingga akan memengaruhi nilai kemurnian DNA.

Dua sampel dari 16 sampel pempek yang memiliki nilai rasio di luar batas 1,8 sampai 2,0 yaitu sampel PM2 dan PM6 (Table 1). Nilai rasio kurang dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi protein pada DNA, sedangkan rasio lebih dari 2,0 menandakan bahwa DNA masih mengandung kontaminasi RNA. Kontaminasi RNA pada sampel DNA akan menaikkan rasio Hal ini disebabkan karena RNA menyerap sinar ultraviolet pada 260 nm sehingga rasio yang dihasilkan lebih besar dari 2 (Riveiro et al., 2022). DNA dianggap cukup murni jika ratio dari dua pembacaan, yaitu berada dalam kisaran 1,7–2,0. Nilai yang lebih rendah dari 1,7 menunjukkan adanya kontaminasi protein, sedangkan nilai yang lebih tinggi dari 2,0 menunjukkan kontaminasi oleh zat pengotor lainnya (Davidescu et al., 2023). Nilai rasio dapat menurun sampai di bawah 1,7 akibat adanya kontaminasi protein, fenol, dan etanol sehingga berdampak pada rendahnya kemurnian DNA (Riveiro et al., 2022).

Ekstraksi sampel untuk mendapatkan DNA merupakan salah satu tahapan yang harus dilakukan untuk analisis DNA target menggunakan PCR. Oleh sebab itu pemilihan metode ekstraksi DNA merupakan sesuatu yang penting. Pemilihan DNeasy mericon food kit dinilai tepat untuk proses ekstraksi DNA dari sampel daging dan produk olahan daging karena akan menghasilkan data yang optimum (Table 2). Penelitian Hossain et al. (2019) melaporkan bahwa daging dan produk olahan ikan yang diekstraksi menggunakan DNeasy mericon foodkit menghasilkan data konsentrasi DNA sebesar 54 sampai 183 ng/ µL dan rasio sebesar 1,8 sampai 2,0. Penelitian Sophian (2021) menyatakan bahwa rata-rata nilai konsentrasi dan rasio A260/A280 sampel produk ikan asin sebesar 25,745 ng/µL dan 1,729 setelah diekstraksi menggunakan DNeasy mericon food kit. Piskata et al. (2019) menyatakan bahwa DNeasy mericon food kit memiliki kelebihan lain dalam hal biaya, intensitas tenaga kerja dan waktu yang dibutuhkan bila dibandingkan dengan penggunaan kit atau metode lain untuk mengekstraksi DNA

Uji selektivitas primer DNA ikan sapusapu dilakukan dengan cara membandingkan ada atau tidaknya kurva amplifikasi sampel DNA ikan sapu-sapu dengan DNA ikan lain (ikan tenggiri, makarel, tongkol, nila, mujair, gurame, kembung, lele, dan patin). Jika amplifikasi hanya terjadi pada sampel DNA ikan sapu-sapu maka dapat dikatakan bahwa primer yang digunakan telah spesifik. Penggunaan DNA ikan tenggiri (Arsil et al., 2023), makarel (Asnani et al., 2024), (Rohyani et al., 2023), nila (Hidayati et al., 2022), mujair (Suyatno et al., 2021), gurame, kembung (Wahyudi, 2018), lele (Putri et al., 2022), dan patin (Nasir et al., 2020) dimaksudkan sebagai pembanding karena ikan tersebut merupakan ikan yang biasa dan dapat dijadikan bahan baku pembuatan pempek.

Penelitian Rahayu (2023) menyatakan bahwa ikan sapu-sapu di bantaran Sungai Ciliwung diperjualbelikan untuk dijadikan bahan baku pembuatan siomai, bakso, dan pempek. Oleh sebab itu, analisis DNA ikan sapu-sapu dalam sampel pempek dengan teknik PCR (DNA barcoding) akan berjalan dengan baik bila primer yang digunakan spesifik hanya mengenali DNA ikan sapusapu. Beberapa penelitian terkait analisis DNA ikan sapu-sapu

dengan DNA barcoding telah dilakukan. Penelitian Suseno & Razari (2023) menggunakan desain primer dari sitokrom b (cyt b) untuk analisis DNA ikan sapu-sapu pada otak-otak namun hasil menunjukkan bahwa DNA ikan lele (Clarias sp.) juga dapat teramplifikasi. Analisis DNA ikan sapu-sapu dengan DNA barcoding juga dilakukan oleh Suseno & Razari (2024) pada produk siomai namun DNA ikan gurame (Osphronemus gurami) masih dapat teramplifikasi dengan primer yang digunakan.

Uji selektivitas primer yang digunakan untuk PCR real-time dapat dikonfirmasi melalui analisis in silico dan eksperimental (in situ). Pertama, selektivitas teoritis dinilai dengan membandingkan urutan amplikon dengan urutan spesies yang tidak ditargetkan yang tersedia di GenBank menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dan/ atau primer-BLAST tool untuk memberikan informasi terkait kemungkinan terjadinya reaksi silang (Ye et al., 2012). Dalam penelitian ini, membandingkan amplikon dengan urutas spesies lain yang tidak tertarget menggunakan software Bioedit dan Snapgene. Kedua Reaktivitas silang dari set primer yang dipilih dapat diuji secara eksperimental terhadap spesies yang memiliki kekerabatan genetik dekat dan/atau spesies lain yang bisa terlibat dalam kasus mislabelling produk. Dalam penelitian ini, reaktivitas silang menggunakan DNA ikan yang bisa dan biasa digunakan sebagai bahan baku pembuatan pempek seperti ikan nila, mujair, tongkol, gurame, tenggiri, patin, makarel, kembung dan lele. Hasil reaksi silang yang diharapkan yaitu tidak adanya amplifikasi pada DNA spesies ikan lain selain DNA ikan sapu-sapu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kurva amplifikasi hanya terjadi pada DNA ikan sapu-sapu bila dibandingkan dengan DNA ikan lainnya dengan nilai sebesar 21,12 (Figure 2). Hal ini dapat disimpulkan bahwa primer yang digunakan telah spesifik.

Penelitian ini menggunakan penanda dye untuk analisis kuantitatif pada RT-PCR berupa EvaGreen. Dibandingkan dengan SYBR Green, EvaGreen memiliki beberapa keuntungan di antaranya memiliki tingkat kebisingan latar belakang yang lebih rendah dan sinyal yang lebih kuat, sehingga memungkinkan analisis kurva leleh dan deteksi amplifikasi yang lebih baik (Adams, 2020). Huang et al. (2019) menyatakan bahwa uji RT-PCR berbasis EvaGreen ini merupakan metode yang cepat, sangat sensitif, spesifik, dan hemat biaya untuk mendeteksi DNA target. Penggunaan penanda dye baik itu SYBR Green ataupun EvaGreen mengharuskan penggunaan primer yang selektif dan sensitif sehingga sinyal fluoresens yang dihasilkan hanya berasal dari proses amplifikasi DNA target.

Penggunaan penanda dye dalam metode RT-PCR seperti SYBR Green atau EvaGreen dalam analisis DNA target sebaiknya menambahkan parameter seperti Temperature Melting (Tm). Hal ini dilakukan untuk mencegah adanya sinyal palsu dari amplikon non spesifik dan primer dimer yang terbentuk selama proses PCR (Villa et al., 2017; Kang, 2019). Hasil analisis nilai Tm menunjukkan suhu 77,91oC dengan terbentuk hanya 1 puncak (data tidak ditampilkan). Adams (2020) menyatakan bahwa satu jenis DNA yang dihasilkan dari pasangan primer spesifik akan menghasilkan satu puncak, sedangkan keberadaan lebih dari satu jenis DNA atau dimer primer akan menghasilkan dua atau lebih puncak dan menunjukkan adanya primer yang tidak spesifik.

Kurva standar dalam RT-PCR dapat berfungsi sebagai indikator yang sederhana, cepat, dan dapat direproduksi untuk mengevaluasi efisiensi amplifikasi dan sensitivitas analitis. Kurva standar biasanya dibuat dengan memplot nilai terhadap kuantitas logaritmik DNA referensi (jumlah kopi atau dalam ng dan konsentrasi %), dan diekspresikan dalam bentuk persamaan regresi. Koefisien determinasi (nilai R²) yang lebih tinggi dari 0,98 dianggap sebagai linearitas yang dapat diterima untuk kurva standar (Kang, 2019).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada kurva standar yang dihasilkan, amplifikasi masih terjadi pada konsentrasi DNA terkecil sebesar 0,00064 ng/µL dan memiliki nilai Cq sebesar 38,98 (Figure 3). Kurva standar yang dihasilkan memiliki nilai R2 sebesar 0,9997 dengan persamaan . Kurva standar dibuat dengan melakukan seri pengenceran 5 kali sebanyak 7 titik dimulai dari 10 ng/µL sampai 0,00064 ng/µL.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa amplifikasi terjadi pada semua perbandingan antara bahan dasar dengan daging ikan sapu-sapu yang digunakan (1:1, 5:1, 10:1, dan 20:1). Hal ini dapat terlihat dari nilai Cq yang dihasilkan berturut-turut yaitu 23,55; 23,05; 23,90 dan 23,55 (Figure 4). Hal ini menggambarkan bahwa walaupun daging ikan sapu-sapu yang digunakan sedikit (20:1) dan berada dalam matriks sampel pempek, DNA ikan sapu-sapu masih dapat terekstraksi dan teramplifikasi dengan baik selama proses PCR.

Hariyanta (2024) menyatakan bahwa ikan sapu-sapu mampu bertelur dengan kisaran fekunditas 604 sampai 1.227 butir. Dengan kemampuannya tersebut menjadikan ikan sapu-sapu sangat melimpah di Sungai Ciliwung. Kelimpahan jumlah ikan sapusapu dilaporkan menyebabkan penurunan keanekaragaman jenis ikan di Sungai Ciliwung mencapai 92,5% pada tahun 2010 (Elfidasari, 2020).

Suseno & Razari (2023) menyebutkan bahwa otak-otak yang didapatkan dari sekitar stasiun kereta api di DKI Jakarta mengandung ikan sapu-sapu. Selain otak-otak, penggunaan ikan sapu-sapu sebagai bahan dasar pembuatan siomai juga ditelah dilaporkan oleh Suseno & Razari (2024). Sebetulnya, penggunaan ikan sapu-sapu sebagai bahan dasar pembuatan makanan tidak dipermasalahkan selama ikan sapu-sapu tersebut hidup di perairan yang tidak terkontaminasi logam berat maupun mikroplastik. Hal berbeda justru terjadi pada ikan sapu-sapu yang hidup di Sungai Ciliwung karena beberapa penelitian melaporkan bahwa ikan ini tercemar logam berat dan mikroplastik.

Akumulasi logam berat dalam makanan laut seperti ikan merupakan ancaman baru bagi kesehatan manusia. Konsumsi makanan yang mengandung logam berat merupakan jalur utama masuknya logam-logam tersebut ke dalam tubuh manusia (Negahdari et al., 2021). Penelitian Asnawi (2023) menyatakan bahwa itik yang diberi tambahan pakan berupa daging ikan sapu-sapu yang mengandung logam berat seperti tembaga (Cu) dan timbal (Pb) maka daging dan telur itik yang dihasilkan juga mengandung logam berat tersebut yang melebihi ambang batas aman. Logam berat dapat menyebabkan efek berbahaya seperti karsinogenesis (pemicu kanker), malformasi (cacat lahir), kerusakan sistem saraf, kerusakan sistem reproduksi dan infertilitas pada pria, gagal hati, penyakit kardiovaskular, dan lain-lain (Negahdari et al., 2021).

Kandungan mikroplastik dalam daging ikan sapu-sapu menjadikan suatu ancaman kesehatan lain yang perlu diwaspadai. Bahaya kesehatan yang ditimbulkan bukan hanya dari mikroplastik itu sendiri namun juga dari dari bahan tambahan yang ada pada mikroplastik seperti bahan pewarna, surfaktan, pelembut plastik, bahan penghambat api, dan penstabil/ penyerap sinar UV. Bahan-bahan tersebut efeknya dapat menyebabkan terjadinya mutasi genetik, efek estrogenic, gangguan fungsi ginjal, gangguan sistem reproduksi, gangguan jantung dan lain-lain (Issac & Kandasubramanian, 2021).

Sampel yang digunakan sebanyak 16 sampel pempek, 1 kontrol positif (DNA ikan sapu-sapu) dan 1 kontrol negatif. Analisis DNA ikan sapu-sapu menggunakan metode RT-PCR dengan konsentrasi sampel yang digunakan sebesar 10 ng/uL. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kurva amplifikasi terlihat hanya pada kontrol positif saja dengan nilai Cq sebesar 21,47 sehingga dapat disimpulkan bahwa sampel pempek yang digunakan tidak terdeteksi mengandung DNA ikan sapu-sapu (Figure 5).